金蛤浸膏片治疗系统性红斑狼疮的药效学研究

                           张立亭    张鸣鹤

     【摘要】目的:对中成药金蛤浸膏片药效学及其作用机理进行实验研究。    方法:制备小鼠自身免疫综合征动物模型后，用不同剂量的金蛤浸膏片对模型小鼠灌胃30天，以细胞免疫因子，抗单、双链DNA抗体，T细胞亚群，淋巴细胞转化，尿蛋白变化，足拓肿胀程度等作为指标，观察金蛤浸膏片的药效及其作用机理。同时采用空白对照和雷公藤多贰作为阳性对照进行对比观察。

    结果:雷公藤(100mg/kg/d )组和金蛤浸膏片(800}1000mg/kg/d )组血清IL-1, IL-6水平明显降低;IL-2水平明显升高;抗ssDNA, dsDNA浓度降低;L}-2+明显提高，L3La+降低;尿蛋白明显减少;足历肿胀程度明显减轻。

    结论:中、大剂量的金蛤浸膏片与雷公藤均具有明显的调节免疫作用和抗炎作用，且能明显抑制模型小鼠尿蛋白的渗出。

      金蛤浸膏片是在山东省中医药大学附属医院内科张鸣鹤教授用于临床30余年的验方的基础上研制而成的。金蛤浸膏片由中药双花、蚤休、山英肉、冤丝子、五味子、水蛙、红花、覆盆子等中药材组成，具有清热解毒，健脾益气，补益肝肾的功能，临床主要用于治疗系统性红斑狼疮及其引起的肾脏损害。为探讨其作用机理，我们以空肠弯曲菌CF-1注射昆明种小鼠，构建自身免疫综合征模型，灌胃给与模型小鼠不同剂量金蛤浸膏片后，以细胞免疫因子、抗单、双链DNA抗体(ssDNA, dsDNA )、尿蛋白、足厢部肿胀程度等为指标，观察金蛤浸膏片对模型小鼠的治疗作用及其作用机制。

    一、实验方法

    1.空弯菌诱导自身免疫综合症小鼠模型的建立

   用甲醛化空肠弯曲菌CF-1株辅以佐剂免疫昆明小鼠诱导自身免疫综合征病理模型。昆明小鼠随机分为2组，即生理盐水(NS)组，空弯菌(CF-1 )组。分别给予NS, FCA + CF-1各SOwL/只，左后足拓皮下注射。初免后第15天，两组分别尾静脉注射NS, CF-I菌悬液各0.2 mL/只。第21天测定抗DNA抗体水平，试纸法测小鼠尿蛋白，两者均阳性者为造模成功。

    2.金蛤浸膏片对模型小鼠的治疗作用观察

    选择造模成功的小鼠SO只，随机分为5组，每组10只。另以注射生理盐水(尿蛋白阴性)的小鼠10只为阴性对照。阴性对照组及模型对照组以蒸馏水(O.SmI/d )，阳性对照组以雷公藤多贰片( 100mg/kg/d )，实验各组以金蛤浸膏片水溶液(600mg/kg/d, 800mg/kg/d, 1000mg/kg/d )灌胃，每日1次，连续30天。观察过程中每周用尿蛋白试纸测尿蛋白一次，观察小鼠足肠肿胀情况，试验结束时剪下小腿称重并记录。

    3.酶联免疫吸附实验(ELISA法)测定血清抗自身抗体水平

    (1)抗原包被:酶标板每孔加人100 w L 50 w g/mL的小牛胸腺DNA o 4℃过夜，弃取上清液，每孔加人200 w L洗涤液，洗涤3次，每次3-5分钟。

    (2)用兔血清封闭:370C, 2小时，如上洗涤3次。

    (3)加样:加待测血清样品100},L于上述已包被的反应孔中，置370C, 2小时，保温后，如上洗涤3次，空白孔不加血清，阴性对照孔加人正常小鼠血清。

    (4)加酶标抗体:每孔加人1: 2 000的H”一标记兔抗小鼠IgG IOOwL, 370C, 2小时，之后如上洗涤3次。

    (5.)加底物显色:在lOmL  OPD缓冲液中加人10},L 30%过氧化氢，再于各反应孔中加人此显色液100wL，置37 0C，20分钟。

(6)终止反应:各孔中加人2M HZS04 50 }, Lo

(7)测定:在492nm处测OD值，用酶标指数(EI)表示                    

 被测血清OD值

                      EI=----------------------------------------x 100

                            对照血清OD均值

    4.刀豆蛋白A (ConA)诱导小鼠脾淋巴细胞转化实验

    按常规方法在无菌条件下制备单个小鼠脾细胞悬液，用RPMI-1640完全培养液调整细胞浓度至2x106个//ml，加人96孔培养板中，每孔IOOwI，再加50 w ( ConA液(相当于5 }, glL)，置5% CO2, 37℃培养72h。培养结束前6h加人’H-TdR 10 w 1/孔，培养结束后用多头细胞收集仪收集细胞，滤膜烘干后加人闪烁液，测定cpm.

    5.淋巴细胞亚群测定

    取淋巴细胞分离液ImI置于试管中，3790温育。将小鼠脱颈椎致死，取脾，置于冷的Hanks液中轻轻研碎，100目钢丝网过滤，离心弃上清，用Hanks液悬浮细胞后，在距淋巴细胞分离液1 cm处缓缓加人脾细胞悬液，2000rpm离心20min，用细吸管插人薄层混浊带，吸出单个核细胞置圆底离心试管，加Hanks液离心洗涤3次，取O.ImI，苔盼蓝染色计数，调细胞浓度至1 x 106/ml。分成三管，加人McAbO.1 ml 对照组用等量液置4 9C，30min，洗2次，加人FTTC一兔抗大鼠IgG 0.1 ml, 49v，30min。洗3次，弃洗液，滴片，加盖薄片，荧光显微镜观察，计数200个淋巴细胞，求出荧光细胞百分率。

    6.组织病理学检查

    将新鲜肾脏(组织块)分别用中性甲醛、95%乙醇固定液固定，修成2x4x4mm3大小，固定组织块经脱水(预冷无水乙醇)4次，每次1小时和透明(预冷二甲苯)三次，用石蜡包埋。常规切片，厚3 w m, H.E染色高倍镜下观察并拍照。

    7.统计学处理方法

    采用方差分析及T检验等统计学处理方法处理数据。

    二、实验结果

    1.空弯菌诱导自身免疫综合症小鼠模型的建立

    左后足历皮下注射及尾静脉注射空弯菌后21天，小鼠左后足环肿胀明显，所有小鼠均出现“+~3+”蛋白尿;血清中抗dsDNA抗体、抗ssDNA抗体、抗CF-1膜蛋白(OMP)抗体水平均明显增加。提示造模成功。根据蛋白尿出现程度均匀分组。分别给予不同受试物灌胃。

    2.金蛤片对模型小鼠蛋白尿的影响，结果显示:雷公藤和金蛤片都可有效地降低尿蛋白。

    3.金蛤片对模型小鼠血清中抗dsDNA抗体、抗ssDNA抗体的影响

结果显示:各实验组组间比较[[1], [3], [5j, [6]同[2]比较有显著性差异，P < 0.0 I，可认为雷公藤和金蛤片能降低鼠血清中抗dsDNA和抗ssDNA浓度;[1], [3], [6]间比较无显著性差异(P > 0.05 ),可认为雷公藤同1000m酬金蚁片降低鼠血清中抗dsDNA、抗ssDNA能力类同，均能使其降至正常水平。

4.金蛤片对模型小鼠足拓肿胀的影响

    结果显示:fll. (31. f4]. (s]同[[2]比较，P < 0.01。显示雷公藤及各金蛤片组均对小鼠足踌肿胀有一定的防治作用。各金蛤片组与雷公藤组足重均数比较，[4)[5]与〔3]比较P < 0.01，而[6]组与[3]比较P>0.05，可认为1 OOOmg/d金蛤片与雷公藤二者对小鼠足踌肿胀的防治效果相似。

    5.金蛤片对模型小鼠细胞免疫因子水平的影响

    结果显示:与NS组比较，CF-1组IL-1, IL-6水平显著升高(P<0.01), IL-2水平显著下降(P<0.01 );与模型组比较，雷公藤组、800mg/kg/d·金蛤片组、1000mg/kg/d金蛤片组IL-1, IL-6水平明显降低，P< 0.01, IL-2水平明显升高P < 0.01, 600mg/kg/d金蛤片组差异不显著，P > 0.05;与雷公藤组比较，1000m眺g/d金蛤片组差异不显著P > 0.05，但600m叭酬金蛤片组、800mg/kg/d金蛤片组差异显著P<0.010提示金蛤片及雷公藤均可降低自身免疫综合征小鼠血清IL-1,}IL-6，升高IL-2 0

6.金蚁片又巾漠型小鼠淋巴细胞转化的影响   

7.金蛤片对模型小鼠T细胞亚群的影响

    结果显示，金蛤片可明显提高L}-2+(人CDa)，降低L3La+}人CD8)o

    8.组织病理学检查

    CF-1辅以佐剂免疫小鼠，可引起肾脏的炎性病理损伤。光镜下可见较多肾小球肿胀，球丛毛细血管有中性的白细胞浸润。而金蛤片及雷公藤可明显减低其炎性病理损伤。

    三、讨论

    制作系统性红斑性狼疮(SLE)的动物模型对于研究SLE具有重要意义，也是重要的研究手段之一。通过本课题的研究，。我们认为采用空肠弯曲菌与佐剂诱导的小鼠SLE动物模型(或称自身免疫综合证动物模型)具有造模时间较短，造模费用不太高，造模成功率较高等特点，值得推广使用。

    SLE是一种以B细胞功能亢进，T细胞功能低下为特征的多系统受累的自身免疫病。它显示有细胞免疫因子分泌异常，因而许多研究都集中于探讨细胞免疫因子对SLE致病作用。IL一I可促进B细胞增殖，介导B细胞产生IgG, IgG可形成免疫复合物沉积于血管的基底膜，结合补体而引起炎症和组织损伤。IL一6是免疫反应中的四大炎症介质之一，对SLE出现自身免疫性炎症有重要影响。IL-2有治疗免疫性疾病的作用。但SLE患者由于T淋巴细胞的调控失衡而使IL一2分泌减少，更由于IL-2R的异常增殖使IL一2的消耗增多。因此IL一1, IL一6的增长和IL一2的低下可以反应SLE的活动程度。通过以上实验，使用金蛤浸膏片大、中剂量可以使模型小鼠的IL一I , IL一6明显下降，IL一2明显升高，说明金蛤浸膏片具有较好的抗自身免疫性炎症的作用。

    SLE患者外周血CD4T细胞和CDZZB细胞存在着异常的活化，这种异常的活化是SLE发病的重要机制之一。通过以上实验，使用金蛤浸膏片大、中剂量可以使模型小鼠的淋巴细胞转化率明显下降，L3,LalLyt一2比值增高得以逆转，说明金蚁浸膏片可以有效的抑制亢进的辅助性T细胞。增强抑制性T细胞的作用，并有效地抑制亢进的B细胞免疫作用，从而抑制自身抗体的产生，其作用与雷公藤多贰相似。

  .金蛤浸膏片除能有效的调节免疫外，还能通过上述机制有效地抑制小鼠足踌肿胀和肾脏免疫病理改变。更进一步说明金蛤浸膏片具有较好的治疗自身免疫性炎症，特别是狼疮肾的作用。